单细胞转录组联合线粒体突变追踪识别白血病干细胞的研究

一、急性髓系白血病干细胞识别的研究进展人体内细胞更新率较高的组织如造血系统或消化道系统依赖于各自的成体干细胞维持持续的再生能力。然而这些细胞可能发生突变进而驱动癌症的发生与发展。肿瘤干细胞Cancer stem cells, CSCs在其中发挥关键作用并且是导致疾病复发的重要驱动因素。由于肿瘤干细胞通常具有较低的分裂频率使其成为临床治疗中难以有效靶向的细胞群体。因此亟需开发能够可靠识别肿瘤干细胞的工具与方法。急性髓系白血病AML是研究癌症干细胞的典型模型。在超过70岁的健康个体中约有10%–20%的人其造血干细胞HSCs会获得癌前突变导致少数造血干细胞来源的克隆逐渐占据主导地位。尽管这些白血病前干细胞pre-LSCs仍能生成正常的血液和免疫细胞但其存在最终会推动白血病干细胞LSCs的产生。传统的白血病化疗方案主要靶向“原始细胞”以诱导缓解但由于LSCs常处于静息状态难以被彻底清除导致部分白血病患者复发率较高。数据显示60岁以上AML患者的5年生存率低于15%。因此改善治疗策略的关键在于开发能够特异性靶向LSCs、同时保留健康HSCs的方法而阐明HSCs、pre-LSCs与LSCs之间的基因表达差异则是实现这一目标的重要前提。单细胞基因组学在造血分化模型的构建中具有重要价值但目前根据单细胞转录组数据识别突变或克隆仍存在较大难度。近期一项发表于Nature Communications的文章“Identification of leukemic and pre-leukemic stem cells by clonal tracking from single-cell transcriptomics”报道了一种名为MutaSeq的测序方法及配套的计算工具mitoClone二者结合可利用线粒体突变实现高可信度的克隆识别与追踪。应用该技术研究人员成功区分了AML患者来源的造血干细胞、pre-LSCs、LSCs及造血祖细胞。该研究证明从单细胞转录组中同时获取基因组与线粒体突变信息可用于有效识别癌症干细胞及其特征。二、主要研究内容一MutaSeq一种获取高质量单细胞RNA-seq数据的技术方法为建立基于单细胞转录组数据的高可信度人类细胞克隆追踪实验方法研究人员首先对高测序深度的单细胞转录组测序方法Smart-seq2进行了评估与改进。结果发现在逆转录过程中添加靶向引物会导致额外序列的形成。相比之下在cDNA扩增阶段靶向目标位点不仅能够获得高质量的转录组数据还可将单个细胞捕获的平均靶点数量提升2至4倍。为进一步评估MutaSeq的性能研究团队对一名急性髓系白血病AML患者进行了深度外显子组测序并设计了针对14个核基因突变的引物随后系统比较了MutaSeq与非靶向Smart-seq2在该患者CD34细胞中的表现。结果显示MutaSeq不仅显著提高了每个细胞覆盖的靶位点数量还具有更高的检测精度。值得注意的是与多种单细胞转录组测序方法相比上述两种方法均对线粒体基因组实现了较深的覆盖。综上所述在单细胞转录组测序实验中MutaSeq能够有效覆盖线粒体基因组并在核基因组靶位点覆盖方面优于Smart-seq2。此外该方法无需改变现有Smart-seq2的基本流程仅在cDNA扩增步骤中加入靶向引物即可实现。图1. MutaSeq原理及其性能检测二线粒体与核基因组突变联合优化克隆层级聚类为探究MutaSeq是否能够区分白血病、白血病前及残留的健康克隆研究人员从4例基因型和表型存在异质性的AML患者中获取了单细胞转录组数据并在此基础上同时鉴定核基因组突变与线粒体突变以评估线粒体突变是否可与核突变共同改进克隆层级聚类分析。结果表明与核基因组突变不同基于线粒体突变的克隆鉴定几乎不受基因表达水平或文库质量的影响。由于线粒体基因本身呈现高表达水平即便在较低的测序深度下也能够被可靠检测。更为重要的是基于线粒体突变所鉴定的克隆结构随后得到了靶向单细胞基因组测序的验证。因此该方法能够有效区分白血病、白血病前及健康的克隆当存在线粒体体细胞变异时可显著提高单个细胞归属克隆分配的准确性。图2. 线粒体突变是AML中高度可信的克隆标记三克隆追踪揭示与白血病前及白血病突变相关的细胞分化状态与基因表达模式为确定单个细胞的分化状态研究人员整合了单细胞基因表达数据与克隆追踪结果。分析表明仅依靠单细胞基因表达数据无法区分健康造血干细胞与肿瘤干细胞但结合克隆追踪所获得的突变信息即可高置信度地为细胞分配克隆身份并进一步开展定量分析。结果显示携带白血病相关突变的克隆主要存在于造血干祖细胞中而在淋巴谱系细胞中几乎不存在。相比之下携带白血病前突变的克隆在所有谱系中均有分布但在淋巴系中的比例普遍较低。这些结果提示白血病突变可能在不同谱系上诱导分化阻滞。在此基础上研究人员深入分析了不同突变的分子效应系统比较了仅存在单个突变差异的克隆之间的基因表达谱从而揭示特定突变对人类造血过程的影响。此外通过比较所有白血病前干细胞与非白血病细胞之间的基因表达差异进一步识别出白血病前干细胞中存在的潜在生物标志物或药物靶点。图3. 细胞状态识别及前白血病突变对细胞分化的影响四、研究总结综上所述该研究报道了一种整合单细胞转录组学与克隆追踪的分析策略MutaSeq与mitoClone并在急性髓系白血病模型中验证了该方法的有效性。研究结果表明该策略可用于解析白血病干细胞的分化能力并绘制致癌突变的克隆层级结构。同时基于核基因组与线粒体突变的联合克隆追踪能够清晰区分健康克隆与癌变克隆。在此基础上研究者进一步实现了对白血病干细胞、造血干细胞、白血病前干细胞、健康造血祖细胞及原始细胞的区分进而鉴定出白血病干细胞特异的基因表达模式并探索了白血病突变诱导的分化异常。该研究不仅证明了单细胞多组学方法在表征癌症干细胞方面的潜力也提示所提出的技术策略可推广应用于其他类型癌症的研究中。