前期准备实验动物为获得高活性的细胞出生后1~3天龄的小鼠。试剂与耗材准备好解剖器械、培养基如DMEM、胎牛血清FBS、胰蛋白酶、以及培养皿、离心管、细胞筛网等。 主要操作步骤1. 组织获取开眶取视神经在手术显微镜下通过经颅开眶法或经眼眶外侧开眶法获取P2期小鼠的管内段视神经长度约2mm。建议将获取的组织立即放入预冷的无菌PBS中清洗并去除表面附着的血液和结缔组织。黄色圈中的突出部分为视神经组织视网膜突出部分为视神经组织2. 组织块法原代培养将处理好的视神经组织剪成约1mm³大小的碎块均匀地贴附在培养瓶底壁上培养箱内倒置放置2-4小时使组织块牢固贴壁。之后小心加入含10% FBS的DMEM完全培养基再放回培养箱中继续培养。这个过程通常会使混合胶质细胞主要是星形胶质细胞和少突胶质细胞从组织块中迁移并增殖培养约7天时细胞会出现明显的分层现象星形胶质细胞在底层少突胶质细胞前体细胞散在分布在上层。3. 振荡法分离纯化混合胶质细胞培养的关键步骤为了获得高纯度的星形胶质细胞或少突胶质细胞需要对其进行分离纯化。振荡法是核心手段原理利用星形胶质细胞贴壁牢固而少突胶质细胞前体细胞贴壁相对松散的特点。操作待细胞融合度合适后将培养瓶置于恒温摇床上以特定速度如200-250 rpm振荡一段时间如16-18小时。结果上清液中悬浮的细胞即为少突胶质细胞前体细胞O-2A祖细胞可以通过离心收集。贴壁在瓶底的细胞主要为星形胶质细胞可继续培养或传代。5. 细胞鉴定无论培养何种细胞都需要通过免疫细胞化学如免疫荧光、免疫组化对细胞身份进行最终确认GFAP免疫荧光鉴定星形胶质细胞通常表达GFAP或S100β等标志物。少突胶质细胞成熟通常表达MBP或O4等标志物。少突胶质细胞前体细胞O-2A祖细胞通常表达神经节苷脂GD3。此外也可用流式细胞术对细胞纯度进行定量分析。