Annexin V染色这个实验说难不难说简单也容易翻车。我之前就踩过不少坑——缓冲液配错、贴壁细胞硬上流式、忘了加PI分不清早晚期……浪费了好多时间和样本。后来用了西安百萤生物这款AAT Bioquest品牌Annexin V-XFD594荧光结构和Alexa Fluor 594完全一样但价格友好很多慢慢把流程捋顺了。下面这份操作笔记全是实战经验希望能帮你少走弯路。实验前准备这几样先备好先说最重要的结合缓冲液一定要自己配别偷懒用PBS代替。配方给你们抄好了——10 mM HEPES、140 mM NaCl、2.5 mM CaCl₂pH调 to 7.4。配好放4℃就行。细胞每管准备1-5×10⁵个悬浮细胞最好操作。强烈建议顺手做一组阳性对照我一般用星形孢菌素处理Jurkat细胞4-6小时这样至少知道试剂是work的。染色步骤一共就5步收集细胞离心PBS洗一次——这步没难度。用200 μL结合缓冲液重悬细胞一定要用结合缓冲液别用PBS。加2 μL Annexin V-XFD594偶联物。想区分早晚期凋亡的这时候顺手把PI也加进去。室温避光放着30-60分钟。别超时超过2小时背景会高。直接上流式或者拿去显微镜看。就这么简单。几个关键提醒容易翻车的地方孵育完1小时内赶紧上机别拖着。不建议固定固定之后背景会飘高数据不好看。流式的话用红色通道590 nm激发、618 nm发射这个通道和PI可以一起用补偿调一下就行。贴壁细胞比较麻烦消化容易伤细胞。我的经验是直接上显微镜在盖玻片上养细胞、染色、洗两遍用2%甲醛固定一下慢慢看。结果怎么看Annexin V⁻/PI⁻活细胞啥事没有。Annexin V⁺/PI⁻早期凋亡这就是你想抓的目标。Annexin V⁺/PI⁺晚期凋亡或坏死也算凋亡但分不清早晚。这款Annexin V-XFD594我用下来信号亮、背景干净关键是性价比真的高。如果你也在做凋亡检测不妨试试。当然再好的试剂也扛不住操作翻车。钙离子、贴壁细胞、PI复染、分装保存——这四点记住了数据基本稳了。有什么问题欢迎随时交流。产品信息速查货号20096Ex/Em590 / 618 nm就是Alexa Fluor 594那个通道保存-20℃避光别反复冻融